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mRNA体外合成原料酶
mRNA疫苗是将含有编码目标蛋白的mRNA片段以特殊的脂质膜包裹，注入人体细胞内产生抗原，以刺激机体产生特异性免疫反应。相较于其他传统疫苗，其具有安全性高、保护率高、研发周期短、生产效率高等优势。mRNA疫苗的成功问世加快了RNA疗法的发展，其涉及的mRNA类型主要有线性mRNA和circRNA等。
Fig. 1 mRNA疫苗作用机制[1]
线性mRNA体外合成
线性mRNA疗法的关键在于需要在体外高效合成高质量的mRNA，再将mRNA通过递送系统递送至人体中。mRNA体外合成离不开高质量的原料酶。恺佧生物专注于mRNA治疗市场，依托独有的新型功能重组蛋白和高活性蛋白酶类研发生产平台SAMSTM，提供全系列（GMP grade & Research grade）mRNA体外合成所需的的优质原料酶（Fig. 2）。GMP产品的分析方法经系统验证，并进行了全方位的QC放行检测，满足了mRNA 疫苗领域对于上游原料酶的要求。
Fig. 2 恺佧生物提供的全系列mRNA体外合成原料酶(注:GMP和DMF代表产品为GMP级别，并完成DMF备案)
01 质粒线性化
mRNA体外转录的模板通常是质粒DNA，在转录前需要对质粒DNA进行线性化处理，线性化可以确保获得确定长度及序列的mRNA转录本。恺佧生物提供BsaI、BspQI、SapI、XbaI等限制性内切酶，用于线性化模板的制备。
Fig. 3 BsaI酶切活性检测，在20 μl体系加入1 μg质粒，1 μl BsaI（1孔为原液，1-11孔依次2倍梯度稀释），酶切30 min，活性≥20 kU/ml。
Fig. 4 BsaI星活性检测，在20 μl体系中加入1 μg质粒，1 μl BsaI(1孔为原液，1-11孔依次2倍梯度稀释)，酶切16 h，未见星活性。
02 体外转录
体外转录（In Vitro Transcription, IVT）是以线性化质粒DNA为模板，在酶的催化作用下，模仿体内转录过程生成mRNA的技术。恺佧生物提供GMP级T7 RNA Polymerase、Inorganic Pyrophosphatase、Murine RNase Inhibitor、DNase I，助力合成高质量的mRNA。dsRNA是IVT过程中的主要副产物，为此，恺佧生物还开发了一系列的T7 RNA Polymerase突变体，有效降低dsRNA的产生。
Fig. 5 T7 RNA Polymerase转录效率检测，在20 μl体系中，分别以3个质粒（1带poly A尾，2、3不带poly A尾）为模板， 37℃下反应2 h，转录长度分别为2000 nt、4000 nt、2000 nt。T7 RNA Polymerase可高效转录不同长度的mRNA。
Fig. 6 探针法检测T7 RNA Polymerase活性，检测原理为当探针和转录产物特异性结合后构象改变，荧光强度发生变化；分别检测三批次的T7 RNA Polymerase，各重复两次实验，其斜率基本一致，三批次的T7 RNA Polymerase活性稳定。
03 加帽加尾修饰
IVT生成的mRNA的5’端含有三磷酸基团，具有很强的免疫原性，在工业生产中需要对mRNA进行加帽加尾修饰。恺佧生物提供加帽修饰所需的Vaccinia Capping Enzyme和 mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase以及加尾修饰所需的E.coli Poly(A) Polymerase。为精准定量“加帽率”、”Poly(A)尾产物长度”等重要指标，恺佧生物还精心搭建了LC-MS平台并开发了成熟的质谱检测方法，把控酶产品的批次放行，也可根据客户需求提供加帽率、加尾测定服务。
恺佧生物LC-MS平台检测Cap1加帽率
Fig. 7 使用恺佧生物Vaccinia Capping Enzyme和mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase对 mRNA 加 Cap1 帽结构，经 LC-MS 平台检测加帽率为 95.16%。（注：加帽率与酶的性能以及mRNA二级结构等因素有关）
circRNA体外合成
将IVT得到的线性mRNA进一步环化即可得到circRNA。环化方式有I型内含子自剪接、II型内含子自剪接和T4 RNA Ligase等。恺佧生物提供T4 RNA Ligase 1/2和RNase R用于体外RNA环化及circRNA的纯化处理，助力circRNA疗法的产业化发展。
Fig. 8 circRNA体外合成
产品列表
| 货号 | 产品名称 | 规格 | |
| BSA-EE101 | BsaI | 1000 U/5000 U | 立即询价 |
| GMP-BSA-EE101 | BsaI(GMP grade) | 20 kU/400 kU | 立即询价 |
| BSP-BE101 | BspQI | 1000 U/10 kU | 立即询价 |
| SAP-SE101 | SapI | 1000 U/10 kU | 立即询价 |
| XBA-EE101 | XbaI | 2000 U/20 kU | 立即询价 |
| T7P-EE101 | T7 RNA Polymerase | 5000 U/25 kU | 立即询价 |
| GMP-T7P-EE101 | T7 RNA Polymerase(GMP grade) | 50 kU/1 MU | 立即询价 |
| T7P-EE102 | T7 RNA Polymerase Kit | 5000 U/25 kU | 立即询价 |
| PYR-EE201 | Pyrophosphatase, Inorganic | 10 U/50 U | 立即询价 |
| GMP-PYR-YE101 | Pyrophosphatase, Inorganic(GMP grade) | 100 U/800 U | 立即询价 |
| RNI-ME001 | Murine RNase Inhibitor | 2000 U/10 kU | 立即询价 |
| GMP-RNI-ME101 | Murine RNase Inhibitor(GMP grade) | 40 kU/2.2 MU | 立即询价 |
| DNI-EE001 | DNase I | 1000 U/5000 U | 立即询价 |
| GMP-DNI-EE001 | DNase I(GMP grade) | 4000 U/40 kU | 立即询价 |
| VCS-VE101 | Vaccinia Capping Enzyme | 500 U/5000 U | 立即询价 |
| GMP-VCS-VE101 | Vaccinia Capping Enzyme(GMP grade) | 10 kU/1 MU | 立即询价 |
| MEH-VE101 | mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase | 2500 U/25 kU | 立即询价 |
| GMP-MEH-VE101 | mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase(GMP grade) | 50 kU/5 MU | 立即询价 |
| PLA-EE101 | E. coli Poly(A) Polymerase | 100 U/500 U | 立即询价 |
| GMP-PLA-EE101 | E. coli Poly(A) Polymerase（GMP grade） | 5000 U/100 kU | 立即询价 |
| TRL-BE101 | T4 RNA Ligase 1 | 3000 U/30 kU | 立即询价 |
| TRL-BE103 | T4 RNA Ligase 2 | 1000 U/10 kU | 立即询价 |
| TRL-BE104 | T4 RNA Ligase 2 (High Concentration) | 5000 U/50 kU | 立即询价 |
| RNR-EE001 | RNase R | 2000 U/20 kU | 立即询价 |
[1] Chaudhary, N., Weissman, D. & Whitehead, K.A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov 20, 817–838 (2021).
