恺佧生物科技（上海）有限公司

基因治疗解决方案

基因治疗（gene therapy）药物一般通过将外源基因（或基因编辑工具）导入靶细胞或组织，替代、补偿、阻断、修正、增加或敲除特定基因以发挥治疗作用^[1]。按照基因导入人体的方式不同，基因治疗可分为ex vivo疗法（体外离体疗法）和in vivo疗法（体内疗法）。Ex vivo疗法一般在体外将外源基因（或基因编辑工具）导入细胞，制备成为经基因修饰的细胞或细胞衍生产品，最终经回输以发挥治疗作用。In vivo疗法将外源基因（或基因编辑工具）通过非病毒载体（如LNP）或病毒载体（如腺相关病毒AAV、慢病毒LV等）导入人体发挥治疗作用。

Fig. 1 基因治疗^[1][2]

体外酶法合成DNA载体

体外酶法合成DNA载体可以有效替代传统的质粒DNA生产，完美避开生物发酵过程的诸多不可控风险，并且可以在更短的时间内完成工业化生产，达到加快生产、降低成本的目的。在基因治疗领域主要应用于制备AAV、LV等病毒载体。

01 phi29 DNA Polymerase

phi29 DNA polymerase具有很强的链置换活性和连续合成的特性，可用于在体外合成双链DNA。

注：在某些应用场景下，使用此酶会有专利限制

02 TelN Protelomerase

TelN Protelomerase可用于合成线性闭合mini DNA载体，其在识别位点 TelRL（56bp）切割双链DNA，并在酶切位点处留下共价封闭的发夹结构，有效地将环状DNA转化为有发夹末端的线性DNA。在实际应用中会将质粒上的目的片段和骨架序列通过TelRL位点间隔。

注：TelRL底物序列需要专利授权

Fig.2 TelN Protelomerase可有效将环状DNA转化为有发夹末端的线性DNA，其活性与知名供应商相当。在50 μl体系中加入513 fmol dsDNA和不同酶量的TelN Protelomerase（由5 U/assay依次2倍梯度稀释，NC为阴性对照），30℃反应30 min。

03 限制性内切酶

经TelN Protelomerase切割-连接形成的DNA载体有两类，一类含骨架序列，一类含目的片段。骨架序列上有相应的限制性酶切位点，恺佧生物提供高活性的限制性内切酶用于酶切骨架序列。

04 Exonuclease III/T5 Exonuclease

经TelN Protelomerase切割-连接形成的DNA载体有两类，一类含骨架序列，一类含目的片段。骨架序列上有相应的限制性酶切位点，经酶切后形成平末端或粘性末端，进一步经Exonuclease III或T5 Exonuclease作用，达到降解骨架序列，富集目的片段的目的。

Fig. 3 Exonuclease III & T5 Exonuclease有效降解BsaI线性化的双链DNA（BsaI酶切后形成5’突出末端），而对TelN Protelomerase线性化的双链DNA无影响(TelN Protelomerase线性化形成带有发夹末端的线性DNA )。在20 μl反应体系中加入2 μg 经BsaI/TelN Protelomerase处理过的双链DNA和100 U Exonuclease III/20 U T5 Exonuclease，37℃下反应30 min。

注：图中的Exo III代表Exonuclease III；T5 Exo代表T5 Exonuclease

基因编辑疗法

01 Cas9、AsCas12a、hfCas12Max^®等基因编辑核酸酶

主要参与细胞与基因治疗药物（如造血干细胞、T细胞等）的基因修饰, 其中，GMP级Cas9核酸酶于高标准的CGT蛋白酶GMP生产车间生产，并经体外胞内双重验证。已完成DMF备案（编号：036578），并已协助客户完成IND申报；hfCas12Max^®是辉大基因（HuidaGene）自主开发的新型DNA基因编辑工具酶，恺佧生物获得在大中华区研究级蛋白的生产销售排他许可，以及GMP级产品的生产销售普通许可。

Fig. 4 Cas9核酸酶体外切割DNA实验，三批次的Cas9核酸酶的体外切割效率基本相当。

Fig. 5 Cas9核酸酶用于293T细胞、Jurkat细胞、T细胞的基因敲除，其在不同细胞中的基因敲除效率与竞品相当。

Fig. 6 hfCas12Max^®RNP 电转 CD3+ T 细胞后，TIDE 分析B2M 和TRAC 基因敲除效率都超过 90%。

Fig. 7 经流式检测，由 hfCas12Max^®介导的基因编辑系统可以高效地同时敲除 CD3+ T 细胞的 B2M和TRAC ，双基因敲除效率超过 90%。

02 AccuBase^®胞嘧啶碱基编辑器

AccuBase^®是通过基因工程手段设计的CBE，将窗口范围内的 C 脱氨形成 U，U利用细胞内修复机制转变为 T，从而实现C→T的转变，在编辑的过程中不会引入 DSB，确保了编辑的安全性。此外，创造性地将脱氨酶可逆的包裹起来，只有当 sgRNA 与靶位点结合时才能发挥脱氨作用，大幅度降低了与非靶 DNA 的随机结合，可以实现接近零脱靶的效果，同时维持高效的编辑活性。

Fig. 8 使用AccuBase^®分别敲除原代T细胞的PDCD1, TRAC和B2M基因，经流式分析，在蛋白水平上，AccuBase^®对PD1和B2M的敲除效率超过80%，对TRAC的敲除效率达到96%。

Fig. 9 利用GOTI（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection）分析AccuBase^®在全基因组的脱靶水平，发现相比对照组的编辑器（检测出700多个SNV），AccuBase^®得到的SNV与GFP对照组水平接近。

03 Cas9 (CRISPR Associated Protein 9) ELISA Kit

定量检测基因编辑细胞药物在回输人体之前胞外或胞内中Cas9核酸酶的残留。试剂盒检测范围为0.25 ng/ml-16 ng/ml，灵敏度可达0.125 ng/ml。

标准曲线

Fig. 10 拟合标准曲线，R²达到0.9997。

准确度

使用同一试剂盒测试高中低三个不同浓度的Cas9核酸酶在稀释缓冲液中的加样回收率。

Fig. 11 在稀释缓冲液中检测不同浓度Cas9样本的加样回收率均介于80%-120%，表明本试剂盒检测Cas9核酸酶残留的准确度高。

精密度

批内精密度

使用三批次试剂盒分别对高中低三个不同浓度的Cas9核酸酶进行检测，每个样本重复检测10次，计算这10次检测的平均值(M)和标准差(SD)，计算变异系数(CV)。

如Table 1所示，每批次试剂盒检测高中低三个不同浓度的Cas9样本的CV均小于10%，表明试剂盒对Cas9的残留检测具有良好的批内重复性。

批间精密度

使用三批次试剂盒对高中低三个不同浓度的Cas9核酸酶进行检测，每个样本使用同批次检测10次，三批次共检测30次，计算这30次检测的平均值(M)和标准差(SD)，计算变异系数(CV)。

如Table 2所示，每个样本三个批次间的CV均小于15%，表明试剂盒对Cas9的残留检测具有良好的批间重现性。

04 AAV Titration ELISA Kit

AAV是基因治疗领域常用的病毒载体，AAV病毒颗粒滴度的检测方法有Dot blot、TEM、AUC、ELISA、SEC-MALS等。恺佧生物开发了AAV2/5/6/8/9 Titration ELISA Kit，旨在为AAV病毒颗粒滴度的测定提供更便捷、更可靠的解决方案。

标准曲线

Fig. 12 拟合AAV9 Titration ELISA Kit的标准曲线，其定量范围为2.03E+07-1.30E+09 capsids/ml。

特异性

ELISA间接法检测不同浓度的AAV9抗体与AAV2/5/8/9交叉结合，以检测抗体的浓度为横坐标，OD₄₅₀值为纵坐标绘制曲线；ELISA夹心法检测AAV9抗体与完整AAV9以及变性AAV9的结合，以AAV9的颗粒滴度为横坐标，OD₄₅₀值为纵坐标绘制曲线。

Fig. 13 AAV9检测抗体与AAV2/5/8/9交叉结合，结果显示AAV9检测抗体只特异性结合AAV9，不会交叉结合AAV2/5/8的衣壳蛋白。

Fig. 14 AAV9检测抗体与变性AAV9结合检测，结果显示AAV9检测抗体不结合变性的AAV9衣壳。

准确度

使用同一试剂盒测试高中低三个不同滴度AAV9样本在稀释缓冲液中的加样回收率。

Fig. 15 在稀释缓冲液中检测不同滴度AAV9样本的加样回收率均介于80%-120%，表明本试剂盒检测AAV9滴度的准确度高。

05 MaxNuclease全能核酸酶

在基因治疗领域，主要用于药物生产过程中去除宿主DNA和质粒DNA等杂质，GMP级MaxNuclease全能核酸酶于高标准的CGT蛋白酶GMP生产车间生产，不使用含动物源原材料，分析方法经系统验证，并经过全方位的QC放行检测，满足从研发到商业大规模生产的使用需求，并且已完成DMF备案（编号：036799）。

Fig. 16 MaxNuclease降解核酸效果

06 MaxNuclease ELISA Kit

定量检测基因治疗药物中MaxNuclease全能核酸酶的残留，试剂盒检测范围为46.88 pg/ml-3000 pg/ml，灵敏度可达23.44 pg/ml。

Fig. 17 拟合标准曲线，R²达到0.9995。

产品列表

货号	产品名称	规格
PHI-BE101	phi29 DNA Polymerase	500 U/5000 U	立即询价
TLN-BE001	TelN Protelomerase	10 kU/50 kU	立即询价
BSA-EE101	Bsal	1000 U/5000 U	立即询价
GMP-BSA-EE101	Bsal(GMP grade)	20 kU/400 kU	立即询价
BSP-BE101	BspQl	1000 U/10 kU	立即询价
SAP-SE101	Sapl	1000 U/10 kU	立即询价
SAP-SE102	Sapl V2.0	1000 U/10 kU	立即询价
XBA-EE101	Xbal	2000 U/20 kU	立即询价
KPN-KE101	Kpnl	2000 U/20 kU	立即询价
NRU-RE101	Nrul	2000 U/20 kU	立即询价
SAL-SE101	Sall	2000 U/20 kU	立即询价
EXO-EE101	Exonuclease III	500 U/5000 U	立即询价
T5E-PE101	T5 Exonuclease	1000 U/10 kU	立即询价
KACTUS-CAS9	Cas9 Nuclease	1 mg/3 mg	立即询价
KACTUS-CAS9-GMP	Cas9 Nuclease (GMP grade)	3 mg	立即询价
CAS-MM00B	Cas9 (CRISPR Associated Protein 9) ELISA Kit	96 T	立即询价
CAS-EE111	SpCas9 D10A Nickase	1 mg	立即询价
CAS-EE121	AsCas12a Nuclease	1 mg	立即询价
CAS-EE128	hfCas12Max^®	500 μg/1 mg	立即询价
KD-0001	BS-EP1（Trade name: AccuBase^®）	200 μg/500 μg/1 mg	立即询价
GMP-KD-0001	BS-EP1（Trade name: AccuBase^®), GMP grade	1 mg	立即询价
AV2-MM00B	AAV2 Titration ELISA Kit	96 T	立即询价
AV5-MM00B	AAV5 Titration ELISA Kit	96 T	立即询价
AV6-MM00B	AAV6 Titration ELISA Kit	96 T	立即询价
AV8-MM00B	AAV8 Titration ELISA Kit	96 T	立即询价
AV9-MM00B	AAV9 Titration ELISA Kit	96 T	立即询价
NUC-SE101	MaxNuclease全能核酸酶	50 kU/250 kU/5 MU	立即询价
GMP-NUC-SE101	MaxNuclease全能核酸酶(GMP grade)	250 kU/5 MU	立即询价
NUC-SE00B	MaxNuclease ELISA Kit	96 T	立即询价

[1] 体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）

[2] Savić N, Schwank G. Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing. Transl Res.

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